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一文讀懂美國ABI熒光定量PCR的主要對照
點(diǎn)擊次數：1868 更新時(shí)間：2021-11-20
 
　　美國ABI熒光定量PCR對照的目的是對檢測的各個(gè)環(huán)節進(jìn)行監控，因此我們按照檢測的流程對對照進(jìn)行梳理。
 
　　常規熒光定量PCR的流程是：樣品采集-運輸-樣品處理-核酸提取-反轉錄(RNA病毒)-擴增-結果讀取。
 
　　下面看看各個(gè)環(huán)節都可以使用哪些美國ABI熒光定量PCR對照？
 
　　1、陽(yáng)性對照和陰性對照
 
　　陽(yáng)性對照和陰性對照是指在相同的處理條件下，比如一份已知的感染樣品和一份已知的未感染樣品，都進(jìn)行了提取和擴增最終獲得了陽(yáng)性結果和陰性結果。陰陽(yáng)性對照強調處理過(guò)程與樣品一致，并且有明確的預期結果。
 
　　2、擴增對照
 
　　我們通常說(shuō)的陽(yáng)性對照和陰性對照指的是擴增試劑盒中附帶的不需要提取的陽(yáng)性對照和陰性對照，更準確的定義應該是擴增陽(yáng)性對照和擴增陰性對照。擴增陽(yáng)性對照含有陽(yáng)性擴增模板，擴增陰性對照應含有陰性擴增模板(基質(zhì)核酸)。擴增對照只能監控每次擴增過(guò)程中的擴增系統是否正常，不能監控采樣、提取和每份樣品的操作過(guò)程。如果是檢測RNA樣品的檢測試劑盒，其擴增陽(yáng)性對照使用質(zhì)粒，便無(wú)法監控反轉錄過(guò)程。
 
　　3、內標(InternalControl，IC)
 
　　內標是指在同一反應管中與靶序列共同擴增的一段非靶序列分子。內標有兩種形式，一種是使用天然樣品中含有的內參基因作為內標，另一種是人工添加的內標。內標的最大特點(diǎn)是與靶序列共同擴增，而其他的對照都是獨立擴增。
 
　　(1)內參基因
 
　　通常它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測基因的表達水平變化時(shí)常用它來(lái)做參照物。內參基因通常是持家基因(house-keepinggene)因為其表達水平受環(huán)境因素影響較小，而且在個(gè)體各個(gè)生長(cháng)階段的幾乎全部組織中持續表達變化很小。常用的內參基因包括GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。
 
　　內參基因的優(yōu)點(diǎn)是與樣品中的靶基因經(jīng)歷*相同的處理程序，可以監控采樣，運輸，核酸提取和擴增的全部過(guò)程。缺點(diǎn)是不同物種，不同生理狀態(tài)下，不同組織中的內參基因存在一定的差異。如果樣品類(lèi)型是口腔液，咽拭子等樣品，內參基因的量很低可能導致實(shí)驗不成立。如果檢測的是環(huán)境樣品則內參基因可能*失效。
 
　　(2)人工內標
 
　　添加一種不會(huì )干擾靶序列擴增的人工合成的內標?，F在國外的診斷試劑盒大部分都會(huì )將內標直接添加在反應液中與模板一起擴增，但是這樣的內標不能監控采樣，運輸和核酸提取的過(guò)程。
 
　　還有另一種形式的內標，使用人工合成的假病毒，在核酸提取前在每一份樣品中加入等量的內標，這樣就可以監控樣品的提取到擴增的過(guò)程。但是由于是人工添加到樣品中，仍然不能監控胞內細菌病毒的釋放情況。
 
　　4、核酸提取對照
 
　　可以使用內參基因，假病毒混合基質(zhì)，滅活病毒混合基質(zhì)來(lái)監控提取到擴增的流程。
 
　　5、反轉錄對照(RTcontrol)
 
　　可以使用提取好的RNA內參基因，RNA假病毒混合基質(zhì)，滅活RNA病毒混合基質(zhì)來(lái)監控反轉錄到擴增的流程。
 
　　無(wú)反轉錄對照(no-RTcontrol)含有除反轉錄酶以外的所有成分。
 
　　6、空白對照(Blankcontrol)
 
　　(1)無(wú)模板空白對照
 
　　NTC是指不含有模板(陽(yáng)性模板或者陰性模板)的對照。目前的試劑盒的NC一般都是水或陰性緩沖液，所以NC等同于NTC。其實(shí)兩者有不同的作用。
 
　　(2)儀器空白對照
 
　　NTC是含有引物探針和反應液主要監控引物探針，反應體系有沒(méi)有被污染。這里的儀器空白對照我通常使用的是空反應管來(lái)監控儀器有無(wú)非特異性的熒光信號。
 
　　(3)熒光染料對照
 
　　最常使用的是ROX染料，由于熒光定量PCR的熒光信號在每個(gè)樣品孔會(huì )有微小的差異所以使用特定的ROX熒光染料，系統可以根據ROX熒光染料的信號值來(lái)校準每孔的熒光信號。
 
　　7、質(zhì)控品(Qualitycontrol,QC)
 
　　上述環(huán)節中使用的各種對照大部分是試劑廠(chǎng)家匹配試劑盒使用的產(chǎn)品，有的是實(shí)驗室自制，所以整個(gè)的監控過(guò)程可能存在不夠客觀(guān)和獨立。因此在實(shí)驗室的對照設置中每次檢測都建議使用第三方質(zhì)控品，有條件的使用國家有證標準物質(zhì)(Referencematerial,RM)。由于標準物質(zhì)具有準確量值和計量溯源性，可以更準確的評估整個(gè)試驗流程的準確度。
 
　　8、定值參考品
 
　　醫學(xué)上的定量檢測試劑盒，需要配套定值參考品用于試劑盒的定量檢測使用。