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　　01

 

　　PCR在產(chǎn)物序列中引入了錯誤，這大多是由于聚合酶忠實(shí)性低或者循環(huán)數太多，這時(shí)需要使用帶有校正活性的熱穩定聚合酶，同時(shí)降低循環(huán)數。此外，四種dNTP的濃度不同也會(huì )出現該問(wèn)題，此時(shí)應制備新的濃度相同的dNTP混合物。

 

　　02

 

　　ABI7500熒光定量PCR儀目的條帶很亮，但是邊沿不清楚，前后有拖尾現象。出現這樣的問(wèn)題，則需要進(jìn)行細致的分析，因為引起該問(wèn)題的可能很多?？上葯z查是否模板質(zhì)量問(wèn)題，如有降解等，模板應避免反復凍融。也有可能是抽提RNA時(shí)有污染，則需要重新抽提RNA。此外，也可能是非特異性擴增引發(fā)該問(wèn)題，可提高退火溫度，少循環(huán)次數。電泳緩沖液時(shí)間太長(cháng)，ph值和鹽離子濃度明顯改變、電泳時(shí)電壓太高、電泳液過(guò)久沒(méi)換，電泳膠臟了等都可能引發(fā)該問(wèn)題。如果不是由上述原因引起，則進(jìn)一步檢查加樣量是否過(guò)大，制膠過(guò)程中膠孔是否制好，EB是否沖洗干凈、模板中是否混有基因組DNA或蛋白等。也需考慮是否擴增的條件不合適。針對具體原因再采取相應的措施。

 

　　03

 

　　PCR產(chǎn)物何時(shí)需要用凝膠純化，何時(shí)不需要？當凝膠分析擴增產(chǎn)物只有一條帶時(shí)，則不需要使用凝膠純化。當可見(jiàn)其他雜帶時(shí)，則可能是積累了大量引物的二聚體，在克隆前需要做凝膠純化。

 

　　04

 

　　如果實(shí)驗中沒(méi)有回收到目的片段，則需要繼續進(jìn)行對照實(shí)驗。包括涂布未轉化的感受態(tài)細胞、轉化完整質(zhì)粒，計算菌落生長(cháng)數，測定轉化效率、用pGEM-T或pGEM-TEasy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態(tài)細胞，按照的實(shí)驗步驟進(jìn)行。

 

　　05

 

　　實(shí)驗中出現假陽(yáng)性擴增該怎么辦？這是擴增系統受到污染的表現，應通過(guò)檢查排除污染源。先考慮是否為試劑污染，可將試劑分裝好直接置于PCR儀中擴增進(jìn)行判斷。其次要考慮是否為實(shí)驗室污染，可更換所用的移液器、吸咀管（離心管）等，將試驗中的關(guān)鍵步驟轉移到一個(gè)新的環(huán)境中，判斷是否為實(shí)驗室污染。如果是則需要對整個(gè)實(shí)驗室及實(shí)驗器材*清洗處理，保持良好的通風(fēng)、清潔等。此外，還要考慮是否為采樣污染，一般表現為一批結果陽(yáng)性率很高，一批結果陽(yáng)性率又下降很多，如此反復。解決方法為盡量使用一次試管及吸咀取樣。

 

　　06

 

　　實(shí)驗中出現假陰性擴增該怎么辦？先要考慮是否為儀器故障，ABI7500熒光定量PCR儀儀器應正常運轉，尤其要注意加熱溫度及各管間的差異是否符合實(shí)驗要求，是否出現誤差等。其次要考慮是否為試劑失效或無(wú)效引起，使用有效的試劑。